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    Aniello RUSSO

    Insegnamento di BIOLOGIA MOLECOLARE

    Corso di laurea in SCIENZE BIOLOGICHE

    SSD: BIO/11

    CFU: 8,00

    ORE PER UNITÀ DIDATTICA: 64,00

    Periodo di Erogazione: Primo Semestre

    Italiano

    Lingua di insegnamento

    ITALIANO

    Contenuti

    Genomi, trascrittomi e proteomi. Struttura degli acidi nucleici. Replicazione del DNA, trascrizione e sintesi proteica. Regolazione dell’espressione genica. Metodiche del DNA ricombinante.

    Testi di riferimento

    T. A. Brown – Genomi - EdiSES.
    G. Capranico – Biologia Molecolare – EdiSES.
    J. D. Watson - DNA Ricombinante – Zanichelli.

    Obiettivi formativi

    L’insegnamento si prefigge di fornire le conoscenze e le competenze teoriche ed operative relative alle basi molecolari dei processi biologici, in particolare quelli che coinvolgono gli acidi nucleici. Al termine del corso lo studente sarà in grado di eseguire analisi bioinformatiche e biomolecolari per lo studio degli organismi viventi e sarà capace di affrontare criticamente le tematiche sugli aspetti biomolecolari delle funzioni biologicihe.

    Prerequisiti

    Conoscenze e abilità fornite dal corso di Citologia ed Istologia (esame propedeutico). In particolare, è richiesta la conoscenza degli organuli cellulari e delle loro funzioni.

    Metodologie didattiche

    Il corso è articolato in 64 ore di lezioni frontali e 8 ore di lezioni laboratoriali. Le lezioni frontali verteranno sulle basi molecolari dei principali processi biologici e le metodiche del DNA ricombinante; si avvarranno della proiezione di diapositive con le figure dei libri di testo, volte ad illustrare tutti gli aspetti del programma. Le lezioni laboratoriali saranno tenute nel Laboratorio di Biologia Sperimentale II e consisteranno nell’esecuzione di alcune metodiche del DNA ricombinante. La frequenza delle lezioni non è obbligatoria.

    Metodi di valutazione

    L’esame prevede una prova scritta ed una prova orale. La prova scritta ha una durata di 60 minuti e comprende 15 domande a risposta multipla e 3 domande a risposta aperta. Le domande riguardano la struttura degli acidi nucleici ed i principali processi biologici in cui sono coinvolti, come specificato nel programma del corso. Gli studenti che conseguano una votazione di almeno 18/30 sono ammessi alla prova orale. Questa prevede domande volte a definire la capacità di ragionamento e di collegamento tra i vari argomenti del corso. La valutazione finale sarà espressa in trentesimi e terrà conto dell’esito della prova scritta (50%) e della prova orale (50%).

    Altre informazioni

    Le diapositive mostrate a lezione possono essere scaricate dal seguente sito: https://uninadue.sharepoint.com/sites/docenti/ANIELLO_RUSSO_057594/Materiale%20didattico

    Programma del corso

    CONCETTI DI BASE. Campo di studio della biologia molecolare. Dogma centrale della biologia. Genomi, trascrittomi e proteomi.

    CRISTALLOGRAFIA AI RAGGI X E MODELLISTICA MOLECOLARE. Cristallografia ai raggi X. Modelli molecolari a nastro. Modelli basati sui raggi di van der Waals. Superfici accessibili al solvente e potenziali elettrostatici superficiali.

    STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI. Basi puriniche e pirimidiniche. Nucleosidi e nucleotidi. Legame fosfodiestereo e struttura primaria. Struttura secondaria del DNA. Parametri strutturali del DNA B e DNA A. Struttura secondaria e terziaria degli RNA.

    REPLICAZIONE DEI GENOMI A DNA. Esperimento di Meselson e Stahl. Caratteristiche delle DNA polimerasi. Frammenti di Okazaki. Replicazione in E. coli: primasi, DNA polimerasi III, DNA polimerasi I, DNA ligasi. La replicazione del DNA cromosomale eucariotico: DNA polimerasi alfa, DNA polimerasi delta, ribonucleasi H, endonucleasi FEN1. Replicazione del DNA mitocondriale umano. Ruolo della telomerasi.

    SINTESI E MATURAZIONE DEGLI RNA CELLULARI. Caratteristiche delle RNA polimerasi DNA-dipendenti. Fasi di inizio, allungamento e terminazione della trascrizione in E. coli. Gli operoni. Struttura degli mRNA procariotici. RNA polimerasi eucariotiche e relativi promotori. Fasi di inizio e allungamento della trascrizione operata dalla RNA polimerasi II. Formazione del cappuccio. Terminazione della trascrizione e poliadenilazione. Introni e splicing. Splicing alternativo. RNA editing. Struttura degli mRNA eucariotici maturi. Il codice genetico.

    REPLICAZIONE DEI GENOMI A RNA. Meccanismo di replicazione dei virus a RNA a polarità positiva (flavivirus, picornavirus, retrovirus), virus a RNA a polarità negativa, virus a RNA a doppio filamento. Peculiarità degli hepadnavirus.

    SINTESI PROTEICA. Struttura e funzioni degli RNA di trasporto. Amminoacilazione del tRNA. Caratteristiche strutturali e funzionali dei ribosomi. L’inizio della traduzione in procarioti ed eucarioti. La fase di allungamento della traduzione. La terminazione della traduzione. Il vacillamento. Scivolamento della fase di lettura. Eccezioni all’universalità del codice genetico.

    INTERPRETAZIONE DI UNA SEQUENZA GENOMICA. Struttura tipica dei geni codificanti procariotici ed eucariotici. Schemi di lettura aperti (ORF).

    REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA. Regolazione dell’inizio della trascrizione nei procarioti: controllo costitutivo e controllo regolativo. Il controllo dell’inizio della trascrizione negli eucarioti. Geni housekeeping e geni tessuto-specifici. Motivi strutturali delle proteine che legano il DNA: elica-giro-elica, dito di zinco, cerniera di leucina. Effetti della struttura cromatinica sull’espressione genica: acetilazione e deacetilazione degli istoni; metilazione del DNA. Silenziamento genico mediato dai microRNA.

    METODI DI BASE PER L’ANALISI DEGLI ACIDI NUCLEICI. Spettri UV e quantizzazione spettrofotometrica degli acidi nucleici. Denaturazione termica del DNA e determinazione della temperatura di fusione. Predizione della Tm. Precipitazione degli acidi nucleici con sali ed etanolo. Elettroforesi su gel di agarosio per l’analisi di molecole di DNA lineare, plasmidi ed RNA. Sequenziamento del DNA.

    METODICHE DEL DNA RICOMBINANTE. Isolamento degli RNA e Northern blotting. Marcatura delle sonde mediante nick translation e random priming. Clonaggio del DNA: enzimi di restrizione, DNA ligasi e vettori di clonaggio. Vettori pUC. Vettori di espressione. Clonaggio del DNA nel fago lambda. Isolamento del DNA genomico e Southern blotting. Progettazione, sintesi chimica e marcatura di sonde oligonucleotidiche. Costruzione e screening di genoteche. Costruzione e screening di archivi di cDNA. Reazione a catena della DNA polimerasi e principali applicazioni. RT-PCR. Altre strategie per l’isolamento di geni e cDNA: archivi di espressione ed assemblaggio di geni sintetici. Mutagenesi sito-diretta: mutagenesi a cassetta; mutagenesi per estensione del primer; mutagenesi mediante PCR.

    ESERCITAZIONI IN AULA. Consultazione delle banche dati del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) per la ricerca di sequenze nucleotidiche, sia per parola chiave (Entrez) che mediante criteri di omologia (Blast); consultazione della Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/) per la ricerca delle coordinate atomiche di biomolecole; uso del programma PDBViewer (http://us.expasy.org/spdbv/) per l’analisi della struttura tridimensionale di macromolecole biologiche; analisi di una sequenza nucleotidica per l'identificazione degli elementi tipici di un gene codificante eucariotico.

    English

    Teaching language

    Italian

    Contents

    Genomes, transcriptomes, and proteomes. Structure of nucleic acids. DNA replication, transcription and and protein synthesis. Regulation of gene expression. Recombinant DNA technologies.

    Textbook and course materials

    T. A. Brown – Genomi - EdiSES.
    G. Capranico – Biologia Molecolare – EdiSES.
    J. D. Watson - DNA Ricombinante – Zanichelli.

    Course objectives

    Comprehension of the molecular basis of main biological functions, especially those involving nucleic acids. At the end of the course, the student will be able to perform bioinformatic and biomolecular analyses to study living organisms.

    Prerequisites

    Knowledges and skills furnished by the course of Citology and Histology (propedeutic exam). It is required the knowledge of cell organelles and their function.

    Teaching methods

    64 hours of lessons will be held in a classroom and 8 hours in a laboratory. Lessons will be devoted to the molecular basis of main biological functions; slides will show figures from textbooks to explain the entire program. Attendance is not compulsory.

    Evaluation methods

    The exam comprises a written test and an oral exam. The test lasts 60 minutes and includes 15 multiple-choice questions and 3 open questions. The students that will receive a score of at least 18/30 will be admitted to the oral exam. The oral exam aims at the evaluation of the thinking capacities and linking among the different subjects of the course. The final evaluation will be expressed in thirtieths and will take into account the results of the oral exam (50%) and of the written test (50%).

    Other information

    The slides shown during the lessons can be downloaded from: https://uninadue.sharepoint.com/sites/docenti/ANIELLO_RUSSO_057594/Materiale%20didattico

    Course Syllabus

    BASIC CONCEPTS. Field of study of Molecular Biology. Central dogma of biology. Genomes, transcriptomes, and proteomes.

    X-RAY CRYSTALLOGRAPHY AND MOLECULAR MODELING. X-ray crystallography. Ribbon models. Van der Waals models. Water-accessible surface.

    STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS. Purines and pyrimidines. Nucleosides and nucleotides. Phosphodiester bond. Secondary structure of DNA. Type A and B DNA. Secondary structure of RNA.

    DNA GENOME REPLICATION. Experiment of Meselson e Stahl. DNA Polymerases. Okazaki fragments. DNA replication in E. coli: primase, DNA polymerase III, DNA polymerase I, DNA ligase. Eukaryotic DNA replication. Mitocondrial DNA replication. Telomerase.

    TRANSCRIPTION AND RNA MATURATION. DNA-dependent RNA Polymerase. Transcription in E. coli. Structure of prokaryotic mRNA. Eukaryotic RNA polymerases and their promoters. Capping. Polyadenylation. Splicing. RNA editing. Structure of eukaryotic mRNA. Genetic code.

    REPLICATION OF RNA VIRUSES. Replication of flavivirus, picornavirus, and retrovirus.

    PROTEIN SYNTHESIS. Structure of tRNA. Ribosomes. Protein synthesis in prokaryotes. Protein synthesis in eukaryotes.

    INTERPRETATION OF A GENOMIC DNA SEQUENCE. Typical structure of prokaryotic and eukaryotic coding genes. Open reading frames (ORF).

    REGULATION OF GENE EXPRESSION. Regulation in prokaryotes. Operons. Housekeeping genes. Eukaryotic Polymerase II promoters. Structural motifs of DNA-binding proteins. Acetylation of histones. DNA metylation. RNA interference and microRNA.

    BASIC MOLECULAR BIOLOGY PROCEDURES. UV spectra and DNA quantitation. Thermal DNA denaturation and Tm. Nucleic acids precipitation. Agarose gel electrophoresis. DNA sequencing.

    RECOMBINANT DNA TECHNIQUES. Northern blotting. DNA labeling by nick translation and random priming. DNA cloning: restriction enzymes, DNA ligase, and cloning vectors. pUC vectors. Expression vectors. Cloning in lambda phage. Southern blotting. Oligonucleotide probes. Genomic DNA library screening. cDNA library. Polymerase chain reaction. Site-directed mutagenesis.

    BIOINFORMATIC TOOLS. DNA sequence retrieval by Entrez and BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/). Molecular modeling program PDBViewer (http://us.expasy.org/spdbv/).

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