ITALIANO

Controllo trascrizionale dell’espressione genica in eucarioti: modulazione della struttura
cromatinica, fattori trascrizionali. Controllo post-trascrizionale dell’espressione genica:
maturazione dell’mRNA; controllo della traduzione; RNA silencing. Controllo dell’attività
delle proteine. Real-time PCR. Vettori di espressione. Trasfezione. Modelli murini knock.out
e knock-in. CHiP assay. Microarray.
Esercitazione di Bioinformatica: pratica con i principali strumenti utili per un biologo molecolare.
Esercitazione di Laboratorio di Biologia Molecolare: Isolamento del trascritto codificante la proteina K-Ras mediante RT-PCR da RNA di linee cellulari umane.

1- Alberts B., Johnson A. et al. -Biologia Molecolare della cellula- Quarta edizioneZanichelli
2- Appunti dalle lezioni e slide delle lezioni sul sito web del Dipartimento.
3- Dispense per le esercitazioni pratiche
4-Articoli scientifici forniti dal docente e discussi a lezione

Al termine del corso lo studente avrà acquisito:
-Conoscenza dei principali meccanismi di controllo dell’espressione genica in eucarioti.
-Conoscenza delle più avanzate tecnologie in ambito biomolecolare.
-Capacità di studiare criticamente un fenomento biologico a livello moleclare, immaginando gli approcci spriementali utili per lo studio-
- Capacità di consultare criticamente la letteratura scientifica
- Attitudine a utilizzare la comprensione dei meccanismi molecolari per immaginare metodologie innovative

Conoscenze e abilità fornite dal corso di Biologia Molecolare

48 ore di lezioni frontali erogate dal docente in aula
2 ore: esercitazione di bioinformatica con l'ausilio di PC in aula
6 ore: esercitazioni di laboratorio svolte nel Laboratorio di Biologia Sperimentale
Le frequenza alle esercitazioni non è obbligaoria ma fortemente consigliata per poter meglio assimilare le basi teoriche.

Prova orale.
La prova orale si prefigge l'obiettivo di valutare non solo la comprensione dei singoli argomenti trattati, ma soprattutto la capacità di collegamento tra i vari argomenti del corso. In particolare sarà valutata la capacità di descrivere pathway molecolari alla base del controllo dell'espressione genica, in relazione agli approcci sperimentale utilizzati per chiarirne i dettagli molecolari e la rilevanza biologica.

Allo studente è data la possibilità di sostenere una prova di autovalutazione in itinere, dopo circa 2/3 delle lezioni e consistente nel discutere, anche con l'ausilio di un power point, un articolo scientifico fornito dal docente e attinente al programma svolto.

Lo studente potrà avvalersi del materiale didattico (dispense e slides) pubblicate sul sito web del Dipartimento.

Il docente è disponibile per ricevimento studenti nei giorni indicati, ma anche su richiesta inoltrata via email.

Studio del controllo dell’espressione genica in eucarioti:
Lo studio del controllo trascrizionale. Stato della cromatina e sua dinamicità. Interruttori
genetici: sequenze di DNA consensus, proteine regolatrici dei geni, modalità di
funzionamento, risposta a segnali extracellulari. Isolatori. Metilazione del DNA: DNA
metiltrasferasi eucariotiche; metilazione de novo e di mantenimento; ruolo della
metilazione; isole CpG; imprinting genomico.
Lo studio del controllo post-trascrizionale. Controllo delle modificazioni dell’mRNA:
attenuazione; regolazione dello splicing; regolazione del sito di taglio dell’estremità 3’;
editing. Controllo del trasporto e della localizzazione dell’mRNA.
Controllo della traduzione. IRES. Controllo della degradazione dell’mRNA. Il silenziamento
genico mediato da RNA: significato biologico, meccanismo ed applicazioni.
Lo studio del controllo dell’attività delle proteine. Fosforilazione/Defosforilazione;
segnalazione per fosforilazione; segnalazione da parte di proteine che legano GTP.
Degradazione: il proteosoma, meccanismi di controllo della degradazione; malattie da prioni.
Tecnologie biomolecolari avanzate:
PCR. Principi generali e applicazioni. RT-PCR, 5’- RACE, 3’-RACE, real-time, analisi
SSCP, analisi RAPD. PCR in diagnostica.
Vettori di espressione. Vettori per espressione in procarioti e in eucarioti: principi generali e
applicazioni. Produzione di vaccini ricombinanti: vaccini subunità, vaccini peptidici, vaccini
vettori, immunizzazione genetica.
Trasfezioni. Princiali metodi di trasferimento di acidi nucleici in cellule di mammifero per
l’espressione transitoria o stabile.
Produzione e utilizzo di modelli murini. Produzione e utilizzo per lo studio del controllo
genetico dello sviluppo e del differenziamento. Approcci per lo studio delle regioni di
controllo dell’espressione genica: “gene trap”, “enhancer trap”. Ablazione cellulare.
Produzione di topi transgenici come modello per patologie umane: Analisi del ruolo degli
oncogeni nella genesi del cancro. Ricombinazione omologa; knock-in, knock-out, sistema
Cre-loxP, knock-out condizionale. Il sistema Crispr\Cas9.
Metodi per lo studio dell’interazione DNA/proteina e proteina/proteina. EMSA.
Cromatografie di affinità. Immunoprecipitazione della cromatina. Two Hybrid system.
Analisi del trascrittoma. Microarray. RNAseq: principi di base.
Esercitazioni
1) Bioinformatica in Biologia Molecolare: Ricerca di sequenze geniche in banca dati,
allineamenti di sequenze nucleotidiche e proteiche, design di primer per PCR; banche dati
per lo studio dei microRNA
2) Isolamento del trascritto codificante K-ras mediante RT-PCR da RNA di linee cellulari umane.

Italian

Transcriptional control of gene expression in eukaryotes: modulation of chromatin structure, transcription factors. Post-transcriptional control of gene expression: mRNA maturation; control of mRNA translation; RNA silencing. Control of protein activity. Real-time PCR. Expression vectors. Transfection. Knock-out and knock-in mouse model.; ChiP assay. Microarray.
Practice with the main bioinformatic tools for manipulation of nucleic acids. Laboratory experience: Isolation of human k-ras transcript by RT-PCR from human cell lines RNA.

1- Alberts B., Johnson A. et al. -Biologia Molecolare della cellula- Zanichelli
2- Slides of lessons on web site of Departement
3- Handouts for laboratory experiences
4-Scientific articles

Main aims of the course:
-Knowledge of the main molecular mechanisms involved in the control of gene expression in eukaryotes.
-Knowledge of advanced techniques in Molecular Biology.
-Ability to study a certain biological phenomenon by a molecular point of view, envisaging the experimental approaches.
- Ability to critically study scientific literature
- Attitude to use the knowledge of molecular mechanisms to envisage innovative techniques.

Knowledge and skills provided by the course of Molecular Biology

48 hours: frontal lessons
2 hours: practice with the main bioinformatics tools by PC
6 hours: laboratory experiences in the laboratory of Experimental Biology
Attendance to laboratory experiences are not compulsory, but strongly encouraged to better understand theoretical bases

Oral examination.
The oral examination will ascertain not only the comprehension of the diferent topics, but above all, the attitude to critically link them each other. In particular, it will be evaluated the ability to describe the molecular pathways involved in the control of gene expression, in relation to experimental approaches used to understand them, and their biological relevance.

After 2/3 of the course, the student could take a pre-exam by discussing a scientific article, also with the support of a power point, about one of the topic of the course.

The student will be supported in his own studies by slides and handouts published on web site of Department.

The teacher will be available for students as indicated, and upon request via email.

Study of gene expression control in eukaryots.
Study of transcriptional control. Chromatin and its dynamical changes. Genetic swtches: consensus DNA sequences, modulator proteins, functioning. Isolators. DNA methylation: DNA methyltransferases, de novo and maintnment methylation; CpG island, genomic imprinting.
Post-transcriptional control: Control of mRNA modifications: regulation of splicign, polyadenilation; editing; translocation and loclaization of mRNA. Translation control. IRES. Control of degradation of mRNA. RNA silencing, biological relevance, mechanism and application. Control of protein activity. Phosphorylation/dephosphorylation; signaling by phosphorylation. Degradation: proteosome, ubiquitination; prion disease.
Advanced biomeolecular technologies and applikcation:
PCR: Theoretical basis and applications. RT-PCR. 5'RACE. 3'Race, real time. RAPD-PCR. Applications in dignostics and legal medicine. Expressing vectors in prokaryots and eukaryots: basic principles and apllications, included recombinant vaccines. Transfections.
Mouse models: general principles and application. Gene trap. Enhancer trap. Cellular ablation. Standard and conditional Knock-out and knock-in. Crispr/Cas9.
Mehodologies for study DNA/protein and protein/protein interactions: EMSA; Affinity chromatograhy, ChIP. Two hybrid system.
Analysis of transriptome: Microarray. Introduction to RNAseq.
Bioinformatic practice.
Laboratory experience: isolation of K-ras gtranscript by RT-PCR from human cell lines RNA.